[tel-01077665] Lipase-catalyzed purification and functionalization of Omega-3 polyunsaturated fatty acids and production of structured lipids

Lipases are enzymes with applications extended to a wide variety of industries The variety of lipases applications led to increased research to characterize them and better understand their kinetics and reaction mechanisms and to establish methods for lipase production in homologous and heterologous expression systems Lately enzymatic engineering allowed the improvement of lipase characteristics This thesis project studies the use of lipases for two main objectives lipase-catalyzed purification and functionalization of Omega-3 polyunsaturated fatty acids PUFAs especially cis-4 7 10 13 16 19-docosahexaenoic acid DHA and production of structured lipids SL DHA was used for the synthesis of a pharmaceutical molecule the nicotinyl DHA ester The co-substrate of the reaction was nicotinol an alcohol from the group B pro-vitamin which after absorption is rapidly converted into nicotinic acid Vitamin B3 The enzymatic trans-esterification of DHA ethyl esters with nicotinol was optimised to synthesise an ester presenting the cumulative properties of the two reactants After enzyme immobilized lipase from Candida antarctica Novozym 435 and reaction medium solvent-free system selection the process was optimised A conversion to nicotinyl-DHA superior to 97 % was obtained in 4 hours using 45 gL-1 of enzyme With a productivity of 42 g of product h-1g of enzyme-1This project requires DHA of high purity Enzymatic purification was chosen for the production of DHA concentrates Lipases can discriminate between fatty acids in function of their chain length and saturation degree Lipases react more efficiently with the bulk of saturated and mono-unsaturated fatty acids than with the PUFAs The objective was the discovery of more specific enzymes for DHA purification The lipase Lip2 from Yarrowia lipolytica YLL2 appears as a good candidate since it is homologous to one of the most efficient lipase the lipase from Thermomyces lanuginosus YLL2 enables a high discrimination to be obtained enzyme selectivity being principally due to the positioning of the double-bond the closest from the carboxylic group The highest concentration of DHA was obtained with YLL2 73% with a recovery percentage of DHA-EE of 89% YLL2 is the most efficient described lipase for DHA purificationSite directed mutagenesis was used to improve YLL2 from Y lipolytica Using its three dimensional structure and alignment with homologous lipases targets for site directed mutagenesis were chosen Chosen amino acids were substituted by two amino acids of different sizes From the screening of variants two positions with promising specificities where chosen positions I100 and V235 Finally saturation of both positions and the analysis of their performances in the selected reactions were carried out The last objective was the production of SL by enzymatic acidolysis between virgin olive oil and caprylic or capric acids using immobilized Lip2 from Y lipolytica The SL obtained should be rich in oleic acid at the sn-2 position while C80 and C100 should be mainly esterified at the sn-13 positions Lip2 from Y lipolytica immobilized on Accurel MP 1000 was tested in a solvent-free system The acidolysis reaction of olive oil with C80 or C100 was optimized by response surface methodology RSMLes lipases sont des enzymes présentant un grand intérêt industriel L’intérêt de ces enzymes a conduit à caractériser ces enzymes à mieux comprendre leur mécanisme réactionnel et leur cinétique et à établir des méthodes efficaces de production en système d’expression homologue et hétérologue Plus récemment l’ingénierie enzymatique permet d’améliorer les caractéristiques des enzymes Ce thèse s’est fixé deux objectifs principaux premièrement la purification et la fonctionnalisation d’acides gras poly-insaturés de type Omega-3 PUFAs et spécialement l’acide cis-4 7 10 13 16 19-docosahexaénoique DHA et deuxièmement la production de lipides structurés SL Un premier objectif fut de produire une molécule pharmaceutique le nicotinyl DHA ester Le co-substrat du DHA est le nicotinol un alcool qui après absorption il est rapidement converti en acide nicotinique Vitamine B3 La trans-esterification enzymatique entre l’ester éthylique du DHA et le nicotinol a été optimisée dans le but de synthétiser un ester présentant les propriétés cumulatives des deux réactants Après la sélection de l’enzyme optimale lipase immobilisée de Candida antarctica Novozyme 435 et le choix du milieu réactionnel milieu sans solvant le procédé a été optimisé Une conversion supérieure à 97 % a été obtenu en 4 heures avec 45 gL-1 d’enzyme Dans ces conditions une productivité de 42 g de produit h-1g d’enzyme-1 a été obtenue Ce projet nécessite une haute pureté en DHA Un procédé de purification enzymatique a été choisi Les lipases sont capables de discriminer entre les acides gras en fonction de la longueur de chaine et du degré d’insaturation Les lipases agissent par résolution cinétique en réagissant plus efficacement avec les acides gras saturés et mono-insaturés qu’avec les PUFAs résistants La lipase YLL2 de Yarrowia lipolytica apparait comme un bon candidat car elle est homologue à une des lipases les plus efficaces la lipase de Thermomyces lanuginosus YLL2 a permis d’obtenir une discrimination très efficace Les raisons de la sélectivité de l’enzyme ont été identifiées il s’agit du positionnement de la double liaison la plus proche de la fonction carboxylique La concentration en DHA la plus élevée a été obtenue avec YLL2 73% avec un pourcentage de récupération du DHA-EE de 89% YLL2 est par conséquent l’enzyme décrite la plus efficace pour la purification du DHALa mutagénèse ciblée dans le site actif de YLL2 a été utilisée pour améliorer la sélectivité de cette enzyme L’analyse de la structure 3D et les alignements avec des lipases homologues a permis de choisir les cibles de mutagénèse dirigée Les acides aminés cibles ont été changés de manière à restreindre ou élargir le site actif De ce premier screening de variantes deux positions ont permis d’améliorer la spécificité de l’enzyme les positions I100 et V235 Finalement la saturation de ces 2 positions a été réalisée Le dernier objectif de la thèse était la production de SL par acidolysis enzymatique entre l'huile d'olive vierge et les acides caprylic ou capric utilisant la lipase YLL2 immobilisé Le SL obtenu devrait être riche en acide oléique à la position sn-2 tandis que les C80 et C100 devraient être principalement estérifiés aux positions sn-13 YLL2 immobilisé sur Accurel 1000 a été testé dans un système sans solvant La réaction d’acidolysis d'huile d'olive avec C80 ou C100 a été optimisée avec la méthodologie de surface de réponse RSM



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