[tel-01077762] Mise au point d'outils optogénétiques pour la photorégulation de l'activité des récepteurs canaux P2X

The ATP-gated P2X receptors are trimeric ion channels that are selective to cationsThese ion channels are involved in various physiological processes such as nociception and neuromodulation The study of P2XR physiology suffers from a lack of selective pharmacological molecules Optogenetic pharmacology could solve this problem ln thiswork 1 performed structural studies of P2X receptors and developed an original optochemical tool in order to contrai P2X activity First we localized the ATP-binding sites by creating through a proximity-dependenttethering reaction covalent bonds between a synthesized ATP-derived thiol-reactiveP2X2 agonist NCS-ATP and single cysteine mutants engineered in the putativebinding cavities of the P2X2 receptor Next we demonstrated that tightening of the ATP-binding sites correlates precisely with channel opening in the P2X2 receptor Finally we developed a unique and versatile method in which the gating machinery of the P2X2 receptor was reprogrammed to respond to light We found that channels covalently modified by azobenzene-containing reagents at the transmembrane segments could be reversibly turned on and off by light without the need of the natural ligand here ATP We demonstrated photocontrol of neuronal activity by a light-gatedP2X receptor in which the natural sensitivity to ATP was genetically removed These light-gated P2X receptors represent valuable tools for investigating the physiological functions of P2X receptorsLes récepteurs canaux P2X sélectifs des cations sont activés par l'ATP extracellulaire Les récepteurs P2X remplissent de nombreux rôles physiologiques allant de la nociception à la neuromodulation L'étude du rôle physiopathologique de ces récepteurs souffre d'un manque d'outils pharmacologiques sélectifs L'optogénétique pharmacologique serait une méthode pour palier ce manque Mes travaux se divisent en deux parties l'une concernant l'étude structurale des récepteurs P2X et l'autre présentant le développement d'outils optogénétiques chimiques pour contrôler l'activité des récepteurs P2X Dans une première série d'expériences nous avons identifié le site de liaison de l'ATP par marquage d'affinité dirigé à l'aide d'un analogue de l'ATP thiol réactif Ensuitenous avons démontré le mécanisme d'activation des récepteurs P2X dans une étude utilisant la bioinformatique et l'ingénierie de site zinc Ainsi nous avons établi une corrélation entre l'ouverture du canal et le rétrécissement du site de liaison suite à la fixation de l'ATP Enfin nous avons mis au point une nouvelle stratégie optogénétique chimique appelée optogating permettant de reprogrammer un canal ionique afin de le contrôler par la lumière Nous avons montré qu'un récepteur canal modifié au niveau transmembranaire par un réactif contenant un azobenzène peut être activé réversiblement par la lumière sans recourir au ligand endogène Nous avons réussi à photocontrôler l'activité neuronale à l'aide d'un récepteur P2X activé par la lumièredans lequel la sensibilité à l'ATP a été génétiquement supprimée Cet outil est prometteur pour l'étude du rôle physiologique des récepteurs P2X in vivo



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