[tel-01077812] Analyse de la régulation du gène Hairless et identification des voies de signalisation affectées chez les mutants bald Mill Hill

In Mammals the gene hairless Hr encodes a nuclear factor strongly expressed in skin and crucial in controlling hair follicle integrity and cycling In the absence of a normal and functional Hairless protein the hair bulb undergoes premature apoptosis linked to complete and irreversible loss of hair follicles The hairless phenotype is caused by defective proliferation and migration of the hair follicle stem cells apparently unable to respond to various signalling molecules The HR protein is localised in cell nuclei tightly bound to nuclear matrix and functions as a corepressor for nuclear hormone receptors by its association to chromatin remodelling factors At least in the skin but probably in other organs the HR repressor seems to be responsible for the timing of epithelial cells differentiation and tegument stem cells identity The spatial and temporal Hr gene regulation is still poorly understood and the partners of HR protein await to be identified The main objectives of the thesis were therefore to shed more light on the molecular basis underlying Hr gene function as well as on the HR protein implication in signalling pathways responsible for skin and hair follicle homeostasis The first part of this thesis is thus focused on the fine mapping of cis-elements governing Hr gene basal promoter function and regulation The precise transcriptional initiation start site of the mouse Hr gene was determined and a new 11 kb cis-control element RE1 able to drive reporter expression in skin and brain derived cell lines was identified A deletion analysis and functional exploration have shown that the role of this upstream region is linked to the presence of TR and VDR binding sites In addition a novel cis-regulatory motif UE60 likely to interact with both TRE and VDRE was defined Taken together these findings reveal a complex molecular network that potentially links several signalling pathways in hair follicle formation and stress the importance of the organisation of the regulatory modules at the Hr locus in Mammals A substantial part of the thesis work is dedicated to unravelling the signalling pathways where the Hr gene and the HR protein play a crucial role to control the hair cycle itself A recently described mouse mutation-hairless rhino bald Mill Hill Hrrhbmh was used here as a model system to approach interactions with the vitamin D signalling It was demonstrated that the mutant HR bmh protein although abnormally localised in the cytoplasm is able to interact with the vitamin D receptor but is not able to repress VDR-mediated transactivation Immunofluorescence analysis revealed that HRbmh protein displays an abnormal cellular localization in transfected cell lines as well as in the epidermis and hair follicle of bmh mutant mice Finally the patterns of HRbmh protein extra-nuclear localization were analysed in cell transfection experiments It was established that HR bmh co-localizes specifically with the protein HDAC6 in the cytoplasm and is able to physically interact with it The association of HR bmh with this Ub-binding protein as well as its localisation in late endosomes and lysosomes suggest that endosomal processing and/or proteasome related pathways might be able to shape and modulate the specific skin phenotype of bmh mouse hairless mutantsLe gène hairless Hr des Mammifères code pour un facteur nucléaire qui est fortement exprimé dans la peau et qui semble participer au cycle de renouvellement du follicule pileux En l’absence de la protéine Hairless HR normale et fonctionnelle le bulbe du poil subit une apoptose précoce liée à la perte totale et irréversible de pelage Le phénotype hairless serait donc associé à une prolifération défectueuse des cellules souches du follicule pileux et leur incapacité à migrer et répondre aux multiples signalisations qui régissent leur destinée La protéine HR est localisée dans le noyau étroitement liée à la matrice nucléaire et par son association aux facteurs de remodelage de la chromatine fonctionne comme un corépresseur de récepteurs nucléaires d’hormones Dans la peau mais probablement dans d’autres organes le répresseur HR est responsable de la dynamique dans la différenciation des cellules de la couche basale de l’épiderme et de l’identité des cellules souches du tégument A l’heure actuelle la régulation de l’expression gène Hr dans l’espace et dans le temps n’est pas élucidée et les partenaires de la protéine HR restent élusifs Les objectifs majeurs de cette thèse étaient de mieux comprendre aussi bien les bases moléculaires de la régulation du gène Hr que la façon dont la protéine HR serait impliquée dans les grandes voies de signalisation qui gouvernent l’homéostasie de la peau et du follicule pileux La première partie de cette thèse est ainsi centrée sur l’identification des éléments en cis qui gouvernent la régulation et la fonction du promoteur basal du gène Hr de la souris Le site précis d’initiation de la transcription a été déterminé et un nouvel élément en cis de 11 kb RE1 capable d’activer la transcription dans des lignées cellulaires d’origine neurale et cutanée a été identifié Grâce à une analyse par délétion et exploration fonctionnelle il a été montré que le rôle de ce fragment est lié à la présence de sites de fixation de TR TRE et VDR VDRE De plus un nouveau motif régulateur de 60 pb UE60 capable d’interagir avec TRE et VDRE a été défini Ces données suggèrent l’existence d’un réseau moléculaire complexe qui pourrait lier plusieurs voies de signalisation responsables de la formation du follicule pileux et mettent en relief l’importance de l’organisation des modules régulateurs au niveau du locus hairless des Mammifères Une grande partie du travail de thèse aété consacrée au décryptage des voies de signalisation qui impliquent la protéine HR dans le contrôle du cycle pilaire La lignée de souris mutantes bald Mill Hill bmh récemment décrite a été utilisé comme modèle pour aborder la signalisation par la vitamine D Il a été montré que la protéine mutante HR bmh localisée de façon aberrante dans le cytoplasme pouvait interagir avec VDR mais était incapable de réprimer l’activation de la transcription assurée par l’intermédiaire de VDR Des analyses par immunofluorescence ont également montré que la protéine HR bmh présentait une localisation cytoplasmique anormale pas seulement en transfection transitoire mais aussi dans l’épiderme et le follicule pileux des souris mutantes bmh Enfin les profils de localisation extra-nucléaire de la protéine HR bmh ont été abordés Il a été établi que dans le cytoplasme HR bmh co-localise spécifiquement avec HDAC6 et est capable de se lier physiquement à cette protéine L’association de HR bmh avec une composante des complexes à ubiquitine ainsi que sa localisation dans des endosomes tardifs et des lysosmes suggèrent que la voie endosomale et la dégradation protéique par le protéasome pourraient moduler le phénotype cutané du mutant bmh



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